转录组测序：揭秘生命活动的"基因密码本"
转录组测序（Transcriptome Sequencing，简称RNA-Seq）是一种全面解析生物体在特定状态下所有RNA分子的技术它能精确捕获基因表达动态、发现新转录本，并揭示RNA结构变异，已成为现代生命科学的核心工具下面从技术原理、实验流程和数据分析三部分展开科普
一、技术原理与优势
转录组指特定细胞在某一状态下所有RNA的集合，包括mRNA和非编码RNA（如miRNA、lncRNA等）与传统微阵列技术相比，RNA-Seq具有革命性优势：
高分辨率：单核苷酸精度，避免交叉杂交误差；
无偏好性：无需预先设计探针，可检测未知转录本；
宽动态范围：同时定量高/低丰度转录本（从几个到数十万拷贝）；
多维度分析：支持可变剪接、RNA编辑、融合基因等复杂研究
二、实验流程详解
1.样本制备与RNA提取
样本要求：细胞（≥1×10⁷）、动物组织（≥1g）、植物组织（≥2g）或总RNA（≥10μg，浓度≥100 ng/μl）
RNA提取：使用试剂盒或酚/氯仿法提取总RNA，重点保持RNA完整性
2.RNA质量检测
通过电泳、Bioanalyzer评估RNA完整性（RIN值＞7），NanoDrop/Qubit检测纯度（OD260/280≈2.0）
3.mRNA富集与片段化
真核生物：用oligo(dT)磁珠捕获带polyA尾的mRNA；
原核生物：需去除rRNA（占RNA总量90%以上）片段化：将mRNA随机打断至200-700 bp（高温/酶解法）
4.cDNA合成与文库构建
反转录：用随机六聚体引物合成cDNA第一链
第二链合成：加入dUTP标记链方向（链特异性建库）
文库制备：末端修复、加A尾、连接测序接头，PCR扩增（图1示意流程）
注：需UMI（唯一分子标识）标记以消除PCR重复偏好
5.上机测序
主流平台：Illumina NovaSeq（短读长、高通量）、PacBio/Nanopore（长读长）；
数据量：通常≥10 Gb/样本，深度≥30M reads
三、生物信息分析流程
1.数据质控与清洗
过滤低质量碱基（Q＜20）、接头污染、N率过高序列
工具：FastQC、Trimmomatic
2.序列比对与组装
有参考基因组：
⠀•使用HISAT2/STAR将reads比对至参考基因组
⠀•识别外显子连接点，构建转录本异构体
无参考基因组：
⠀•从头组装（如Trinity软件）
基于de Bruijn图拼接k-mer
⠀•评估组装质量（N50、完整性）
3.转录本定量与差异分析
定量：用Salmon/RSEM计算基因表达量（TPM/FPKM）
差异基因：edgeR/DESeq2基于负二项分布模型筛选（需生物学重复）
4.高级分析
功能注释：GO（基因功能）、KEGG（通路富集）
结构变异：ASprofile分析可变剪接，CIRCexplorer识别环状RNA
分子标记开发：SSR/SNP位点挖掘
四、应用场景
基础研究：胚胎发育、抗逆机制
医学：癌症biomarker发现、药物靶点筛选；
农业：作物抗病基因挖掘
客服