转录组测序的原理及步骤

一、转录组测序的原理

转录组测序的核心原理是将RNA分子转化为cDNA（互补DNA），再通过高通量测序技术读取序列信息，最终通过生物信息学分析量化基因表达其技术基础主要依赖“边合成边测序”（Sequencing by Synthesis,SBS）

基本概念：

转录组是细胞在特定状态下所有RNA的集合，包括编码蛋白的mRNA和非编码RNA测序目标是通过逆转录将RNA转换为更稳定的cDNA，避免RNA降解

高通量测序技术通过并行处理数百万个片段，实现快速、大规模数据获取主流平台包括Illumina（二代测序）和PacBio/Nanopore（三代测序）

测序技术原理：

二代测序（SBS）：这是最常用的方法以Illumina平台为例，其原理是将cDNA片段固定在芯片上，通过“桥式PCR”扩增成簇（cluster），然后加入荧光标记的dNTP（脱氧核苷酸）每次合成一个碱基时，荧光信号被捕获并转化为序列信息，实现“边合成边测序”该方法精度高、成本低，但读长较短（通常150-300 bp）

三代测序：如PacBio的SMRT技术，直接对单RNA分子测序，无需PCR扩增它利用“零模波导孔”（ZMW）原理，通过检测聚合酶合成时的实时信号，获得超长读长（可达10-15 kb），适合复杂转录本分析，但错误率略高

关键优势：与微阵列技术相比，转录组测序具有高分辨率（单核苷酸级别）、高覆盖度（几乎检测所有转录本）、宽动态范围（可量化低至几个拷贝的稀有转录本），并能检测RNA编辑、融合基因等调控事件

数据生成原理：

测序后，原始数据以FASTQ格式存储，包含序列碱基和质量分数通过比对参考基因组或组装新转录本，计算每个基因的表达量（如FPKM或TPM值），揭示差异表达

二、转录组测序的步骤

转录组测序流程分为“湿实验”（wet-lab）和“干实验”（dry-lab）两部分，从样本处理到数据分析共需7个主要步骤不同证据对步骤描述略有差异（如RNA片段化顺序），但整体一致以下是详细解析：

RNA提取：

从细胞或组织（如肿瘤、植物叶片）中提取总RNA，常用试剂盒（如TRIzol）或酚/氯仿法目标是获得高纯度RNA，避免DNA、蛋白质污染样本要求严格：细胞数≥1×10⁷、组织量≥1g、RNA总量≥10μg、浓度≥100 ng/μl

RNA质量检测：

评估RNA完整性、纯度和浓度：

完整性：使用生物分析仪（Bioanalyzer）或凝胶电泳检测RNA降解程度，RIN值（RNA Integrity Number）>7为合格

纯度与浓度：通过NanoDrop或Qubit测量A260/A280比值（理想值1.8-2.0）和浓度，确保无杂质

RNA处理与cDNA合成：

RNA富集与片段化：总RNA需富集mRNA（如使用oligo-dT磁珠捕获polyA尾），或直接使用总RNA随后，RNA被片段化（高温或酶切），使片段长度适宜测序（通常200-500 bp）

逆转录为cDNA：用逆转录酶和随机引物/寡核苷酸引物，将RNA转录为双链cDNA此步骤关键，需避免引入偏差

rRNA去除：针对总RNA样本，需通过杂交或磁珠法去除核糖体RNA（rRNA），减少非目标序列干扰

文库制备：

将cDNA加工为测序文库：

末端修复与加尾：修复cDNA片段末端，添加“A”尾（A-tailing）以连接接头

接头连接：添加测序平台特异性接头（adapter），包含索引序列（barcode）用于样本区分

PCR扩增：通过PCR富集文库，增加cDNA量常用试剂盒如Illumina TruSeq或NEBNext

文库质检：再次用Qubit或生物分析仪检测文库浓度和片段大小，确保合格

高通量测序：

文库加载到测序平台（如Illumina HiSeq或NovaSeq），进行并行测序

桥式PCR扩增：在芯片上通过PCR生成cDNA簇，每个簇代表一个片段

边合成边测序：加入荧光dNTP，逐碱基合成并捕获信号，生成原始序列数据（reads）

输出数据为FASTQ文件，包含序列和碱基质量分数

生物信息学分析：

这是核心“干实验”步骤，通过软件处理原始数据：

数据预处理：

质量控制：使用FastQC检查数据质量，剔除低质量reads

去接头与修剪：用工具如Cutadapt移除测序接头和低质量碱基，避免比对错误

序列比对与定量：

比对参考基因组：用STAR或HISAT2将reads比对到参考基因组（如人类GRCh38），识别外显子、内含子连接位点

基因定量：计算每个基因的表达量（如read counts），工具包括HTSeq或featureCounts

差异表达分析：

使用统计软件（如edgeR或DESeq2）比较不同条件（如正常vs肿瘤）的基因表达差异，基于负二项分布模型处理技术变异

高级分析：

新转录本发现：组装未注释转录本（如用Cufflinks）

功能注释：通过GO（Gene Ontology）或KEGG分析基因功能富集

结果解释与应用：

整合数据生成报告，揭示基因表达模式、调控机制（如可变剪接或融合基因），应用于疾病标志物发现或药物靶点筛选

三、总结与重要性

转录组测序通过结合分子生物学和高通量测序，实现了对转录组的全面“快照”其原理以SBS技术为核心，步骤从样本准备到数据分析环环相扣，需严格质量控制随着技术发展（如单细胞测序），它已成为基因功能研究、精准医疗和生物工程的基石，未来将在个性化医疗和合成生物学中发挥更大作用