PCR循环的三个核心步骤
聚合酶链式反应（PCR）是一种通过温度循环实现DNA指数级扩增的技术每个循环包含以下三步，重复25-40次后，目标DNA片段可扩增数百万倍：
变性（Denaturation）
温度：94–98°C（典型值95°C）
作用：高温破坏DNA双链间的氢键，使双链解离为单链模板
时间：30秒至2分钟（首次变性常延长至5分钟以彻底解链）
分子机制：高温导致碱基间氢键断裂，双螺旋结构解开
退火（Annealing）
温度：50–65°C（通常比引物熔解温度Tm低5°C）
作用：降温使引物（短单链DNA片段）特异性结合到模板DNA的互补区域
时间：20–60秒
关键因素：
温度过高→引物结合不牢；温度过低→非特异性结合
引物设计需匹配目标序列，长度通常18-25个碱基
延伸（Extension）
温度：72°C（Taq DNA聚合酶的最适温度）
作用：DNA聚合酶以单链为模板，沿引物3'端合成互补链，生成新双链DNA
时间：每1 kb DNA约需30–60秒（最终延伸延长至3–5分钟确保完整合成）
酶活性：
耐热DNA聚合酶（如Taq酶）在高温下保持活性，避免每轮添加新酶
按5'→3'方向添加脱氧核苷酸（dNTPs）延伸新链
循环过程的动态变化
指数扩增原理：每完成1个循环，目标DNA数量翻倍（理论值）例如：
循环1→2条新链
循环3→8条新链（含2条目标长度片段）
循环30→可达10^9倍扩增
温度控制要求：PCR仪需精准快速切换温度，确保各步骤高效进行
关键注意事项
引物设计：
特异性决定扩增准确性，避免与非目标序列结合
循环数优化：
初始DNA量越少，所需循环数越多（如单拷贝基因需40循环，高浓度样本仅25循环）
酶与试剂：
现代PCR使用热稳定聚合酶（如Taq酶），替代早期Klenow片段（需每轮补加）
可视化理解
图示流程：
变性（95℃）→退火（55℃）→延伸（72℃）→重复循环…
（参考温度-时间曲线）
分子动态：
引物（蓝色）结合模板后，聚合酶（红色）合成新链（绿色）
总结：
PCR通过三步温度循环实现DNA精准扩增，其核心在于变性分离、退火结合、延伸合成的高效重复该技术自1980年代发展至今，已成为分子生物学、医学诊断等领域的基石
客服