一、PCR基本原理
PCR是一种体外扩增特定DNA片段的技术，通过模拟DNA自然复制过程，在数小时内实现目标序列的指数级增长（可扩增百万倍以上）
其核心原理基于DNA半保留复制，依赖热稳定性DNA聚合酶（如Taq酶）和特异性引物
二、完整操作步骤
1.实验准备（Pre-preparation）
试剂配制：
反应体系需包含以下关键成分：
模板DNA：基因组DNA、质粒或cDNA，纯度要求不高但需避免降解
引物：一对寡核苷酸链（通常18-30 bp），需满足：
GC含量约50%，确保退火温度（Tm）在56-62℃
避免自身互补，防止引物二聚体
酶与底物：
Taq DNA聚合酶（耐高温）
dNTPs（四种脱氧核苷酸等浓度混合）
Mg²⁺（1.0-1.5 mM，激活聚合酶）
缓冲液：维持pH（通常Tris-HCl）并含KCl等稳定剂
防污染措施：
穿戴手套、使用无菌水和0.2μm滤膜过滤试剂，操作区紫外线消毒
2.扩增循环（Amplification Cycles）
反应在热循环仪中进行，每循环含三步，重复25-40次
变性（Denaturation）：
温度：90-96℃（常用94-95℃）
时间：30-60秒
作用：破坏氢键，使双链DNA解离为单链
退火（Annealing）：
温度：50-70℃（依引物Tm值调整）
时间：30-60秒
作用：引物特异性结合模板DNA的互补序列
延伸（Extension/Elongation）：
温度：70-75℃（Taq酶最适温度）
时间：30-90秒（一般按1分钟/1 kb DNA计算）
作用：聚合酶沿模板合成新链，从引物3'端延伸
特殊设计：
首循环前预变性：95℃5分钟，确保DNA完全解链
最终延伸：72℃5-10分钟，补平未完整延伸的DNA
热启动PCR：聚合酶在首轮变性后才激活，减少非特异结合
3.产物分析（Post-PCR Analysis）
常规PCR：
通过琼脂糖凝胶电泳（浓度依片段大小选0.8%-2%）检测，溴化乙锭染色观察条带
荧光定量PCR（qPCR）：
实时监测荧光信号，直接定量目标DNA
测序/杂交：用于高精度验证
三、关键优化因素
引物设计：
长度18-30 bp，避免3'端互补
保守序列区域设计可提高特异性
温度控制：
退火温度需精确计算，可试用梯度PCR优化
试剂浓度：
Mg²⁺浓度过高导致非特异扩增，过低抑制酶活
dNTPs浓度不均易引入突变
四、常见问题与解决
问题可能原因解决方案
无扩增条带引物设计错误/酶失活重新设计引物，更换酶
非特异条带退火温度过低/Mg²⁺过高优化温度，调整Mg²⁺
引物二聚体引物3'端互补修改引物序列
五、PCR技术变体与应用
逆转录PCR（RT-PCR）：扩增RNA病毒（如新冠病毒），需先反转录为cDNA
巢式PCR（Nested PCR）：两轮扩增提高罕见目标检出率
实时荧光定量PCR（qPCR）：疫情监测中病毒载量定量
降落PCR（Touchdown PCR）：循环中逐步降低退火温度，增强特异性
六、意义与发展
自1983年Kary Mullis发明PCR以来，该技术推动了基因工程、法医学（DNA指纹）、疾病诊断（遗传病筛查）等领域飞跃
现代自动化设备使PCR可在1-4小时内完成，成为分子生物学基石
客服