一、实验原理
全血DNA提取的核心目标是分离白细胞中的基因组DNA由于成熟红细胞无细胞核，需先裂解红细胞并保留含DNA的白细胞关键原理包括：
抗凝处理：采集时需使用EDTA或肝素抗凝剂防止血液凝固，保护DNA稳定性
红细胞裂解：通过低渗溶液选择性裂解红细胞，保留白细胞沉淀
白细胞裂解与去蛋白：用SDS（十二烷基硫酸钠）或蛋白酶K破坏细胞核膜，释放DNA，并通过有机溶剂（酚/氯仿）或盐析法去除蛋白质杂质
DNA沉淀纯化：乙醇或异丙醇沉淀DNA，去除盐分和残留溶剂
二、标准实验步骤
1.样本采集与预处理
采集5-10ml静脉血至EDTA抗凝管，4℃保存避免DNA降解
关键点：肝素抗凝可能抑制后续PCR反应，推荐EDTA抗凝
2.红细胞裂解
加入3-5倍体积红细胞裂解液（如0.1M NH₄Cl或商品化RLB液），轻柔混匀后冰浴10分钟
离心（1500-2000g，10分钟），弃红色上清，保留白色白细胞沉淀
3.白细胞裂解与DNA释放
方法一（蛋白酶K消化）：
沉淀中加入核裂解液（含SDS、Tris-HCl、EDTA）和蛋白酶K（终浓度100μg/ml），55-65℃孵育3-4小时或过夜
方法二（盐析法）：
加入饱和NaCl溶液（6M），剧烈振荡后离心沉淀蛋白质，上清液含DNA
4.DNA纯化
有机溶剂法：
裂解液与酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合，离心后取上层水相
试剂盒法（主流方法）：
裂解液转移至硅胶膜吸附柱，离心去除杂质，再用70%乙醇洗涤
5.DNA沉淀与溶解
水相加等体积异丙醇或2倍体积冷乙醇，轻柔颠倒混匀至DNA絮状析出
离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤后干燥，溶于TE缓冲液（pH 8.0）或超纯水
三、质量控制与常见问题
1.质量检测
纯度：分光光度计检测OD260/OD280比值（1.8-2.0为佳），比值<1.8提示蛋白质污染
浓度：理想范围50-100ng/μL
完整性：琼脂糖凝胶电泳，清晰条带无拖尾表明无降解
2.常见问题与优化
问题原因解决方案
DNA产量低红细胞裂解不彻底增加裂解液体积或延长裂解时间
蛋白质污染酚/氯仿抽提不充分重复抽提或改用盐析法
DNA降解样本保存不当或操作剧烈全程低温操作，避免剧烈振荡
PCR抑制肝素残留或乙醇未除净改用EDTA抗凝，延长干燥时间
四、技术对比与选择建议
方法优点缺点适用场景
有机溶剂法成本低，DNA完整性好有毒试剂，操作复杂科研实验室
盐析法安全快速，无需有毒试剂DNA纯度略低大规模临床检测
试剂盒法操作简便，30-40分钟完成成本较高常规诊断与高通量实验
注：试剂盒法（如天根DP349、QuickGene）已逐步成为主流，尤其适合临床和小样本
五、应用领域
提取的DNA可用于：
遗传病诊断：如地中海贫血基因检测
法医学：STR分型用于亲子鉴定
感染病研究：病原体DNA检测
肿瘤标志物分析：循环肿瘤DNA研究
六、未来发展方向
自动化提取：整合微流控技术实现全流程自动化
免提直接扩增：开发直接PCR血液样本技术，省略提取步骤
通过标准化操作和质控，全血DNA提取已成为分子生物学和精准医疗的基石技术
客服