一、基本原理
DNA提取的核心目标是从血液中分离高纯度基因组DNA,用于PCR、测序等后续实验传统酚氯仿法因毒性大、步骤繁琐,已被试剂盒技术取代现代试剂盒通过优化裂解液和吸附材料(硅胶膜或磁珠),实现高效安全的提取,流程分为四步:
细胞裂解:裂解液破坏细胞膜释放DNA(如Buffer BL、蛋白酶K)
蛋白质去除:蛋白酶K消化蛋白质,有机溶剂(乙醇/异丙醇)沉淀杂质
DNA纯化:硅胶膜/磁珠特异性吸附DNA,离心或磁力架分离杂质
洗脱溶解:缓冲液(如TE或Buffer EB)洗脱DNA,溶解备用
关键创新:硅胶膜/磁珠的高效吸附取代有毒有机溶剂,操作时间从数小时缩短至1小时内
二、主流操作步骤(以两类试剂盒为例)
1.硅胶膜吸附柱法(蛋白酶K法)
步骤1:裂解消化
血液样本加入裂解液(如Buffer GB)和蛋白酶K,混匀后65℃孵育10-30分钟,彻底消化蛋白质
步骤2:沉淀吸附
加入无水乙醇/异丙醇沉淀DNA,转移至吸附柱离心,DNA被硅胶膜捕获
步骤3:洗涤纯化
用70%乙醇洗涤2次,去除盐类和残留蛋白
步骤4:洗脱DNA
加入洗脱缓冲液(如Buffer EB),室温离心收集DNA
2.磁珠法(高通量首选)
步骤1:前处理
血液加Buffer C1冰浴裂解红细胞,离心弃上清
步骤2:结合纯化
裂解液加入磁珠和结合缓冲液(如Buffer PB),冰浴吸附DNA
步骤3:洗涤干燥
依次用Buffer WS、WB和75%乙醇洗涤,磁力架分离后室温干燥5分钟(避免乙醇残留)
步骤4:洗脱DNA
预热Buffer EB震荡洗脱,50℃孵育10分钟提升得率
效率对比:磁珠法更适自动化,1小时可处理96个样本;硅胶膜法成本低,适合小规模实验
三、关键注意事项
样本处理
优先使用新鲜抗凝血(EDTA抗凝最佳),反复冻融会导致DNA降解
肝素抗凝血需特殊处理,否则抑制后续PCR
试剂操作
缓冲液使用前需平衡至室温,含沉淀时需37℃水浴溶解(如Buffer EB)
乙醇必须现配75%浓度,过量残留影响酶活性
关键步骤控制
裂解时间:陈旧血样需延长至30分钟以上
干燥程度:吸附柱/磁珠过度干燥会降低DNA溶出率
安全防护
Buffer BL等裂解液具强腐蚀性,操作需戴护目镜及手套
四、常见问题与解决方案
问题原因解决措施
DNA产量低裂解不充分或血细胞残留增加蛋白酶K用量或延长孵育时间
DNA纯度不足蛋白或乙醇残留增加洗涤次数或更换新批次试剂
DNA降解高温或机械剪切操作全程保持4℃环境,轻柔混匀
五、技术优势与应用
高通量兼容:单次提取可得4–30μg DNA,支持NGS测序等大规模研究
安全性提升:避免酚氯仿等有毒试剂,降低实验风险
自动化趋势:磁珠法试剂盒可匹配自动化设备,提升实验室效率
结语
血液DNA提取试剂盒通过标准化流程显著降低了实验门槛选择硅胶膜法或磁珠法需权衡样本量、成本与自动化需求,严格遵循操作规范可稳定获得高纯度DNA,为基因诊断、法医学和精准医疗奠定基础