PCR扩增的流程

一、反应体系准备

PCR反应需在专用离心管中配制包含以下成分的混合液：

模板DNA：双链或单链DNA，提供待扩增的目标序列。

引物：一对寡核苷酸片段，分别与目标DNA的两端互补，决定扩增的特异性。

耐高温DNA聚合酶（如Taq酶）：催化DNA链的合成，需耐受高温变性步骤。

脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：提供DNA合成的原料。

缓冲液：含Mg²⁺等离子，维持反应体系的pH和酶活性。

混合液配制完成后需短暂离心以去除气泡，随后放入PCR仪中进行扩增。

二、循环扩增

PCR通过变性-退火-延伸三步循环（通常25-35次）实现DNA指数级扩增：

变性（Denaturation）

温度：94-98°C，持续20-30秒。

作用：高温使双链DNA解离为单链，作为后续扩增的模板。

退火（Annealing）

温度：50-65°C（依引物Tm值调整），持续20-60秒。

作用：引物与模板DNA的互补区域结合，形成局部双链。

3.延伸（Extension）

温度：72°C，时间依目标片段长度而定（一般1分钟/1kb）。

作用：DNA聚合酶以dNTPs为原料，沿模板从引物3'端合成互补链。

每完成一次循环，目标DNA数量翻倍（理论值）。经过30次循环后，DNA可扩增至约10⁹倍。

三、产物检测

扩增结束后需验证产物是否符合预期，常用方法包括：

琼脂糖凝胶电泳：通过电泳分离DNA片段，紫外灯下观察条带大小。

荧光定量检测：若使用荧光染料或探针（如SYBR Green、TaqMan），可实时监测扩增曲线。

数字PCR（dPCR）：将反应液分割为微滴，通过统计阳性/阴性信号实现绝对定量。

四、技术变体与应用

基础PCR可衍生出多种改进技术：

逆转录PCR（RT-PCR）：以RNA为模板，先逆转录为cDNA再扩增，用于基因表达分析。

热启动PCR：通过修饰酶或抗体抑制非特异性扩增，提高反应特异性。

多重PCR：在同一反应中使用多对引物，同时扩增多个目标片段。

五、关键注意事项

污染控制：气溶胶可能导致假阳性，需在超净台操作并使用无DNA酶耗材。

引物设计：需避免二聚体及非特异性结合，常用软件（如Primer3）辅助设计。

温度参数优化：退火温度过高会导致引物无法结合，过低则增加非特异性扩增风险。

结语

自1983年发明以来，PCR技术已成为分子生物学、医学诊断（如新冠检测）、法医学等领域的基石。其高效、灵活的特点使其持续推动生命科学研究的进步。