PCR的基本过程

一、PCR的三个核心步骤

PCR的核心是通过温度调控重复循环三个步骤，实现DNA的指数级扩增：

变性（Denaturation）

温度：90–96℃（通常采用94–95℃）。

作用：高温破坏双链DNA的氢键，使其解链为两条单链DNA模板，为后续引物结合做准备。

时间：约30秒至1分钟。

退火（Annealing）

温度：40–65℃（具体取决于引物的设计，通常比引物熔点低3–5℃）。

作用：系统降温后，引物（短单链DNA片段）通过碱基互补配对与目标DNA的侧翼区域结合。引物的特异性决定了扩增的靶序列

时间：约20–40秒。

延伸（Extension）

温度：68–75℃（Taq酶最适活性温度为72℃）。

作用：耐热DNA聚合酶（如Taq酶）以单链DNA为模板，从引物的3'端开始合成互补链，形成新的双链DNA。

时间：根据目标片段长度调整，通常每千个碱基需1分钟

二、循环次数与指数扩增

循环设计：上述三个步骤构成一个循环，通常重复25–35次。

扩增效率：理论上每个循环使DNA拷贝数翻倍（2^n，n为循环次数）。30次循环可产生约10^9倍扩增

实际限制：由于反应物消耗和酶活性下降，后期扩增效率降低，进入“平台期”

三、关键组分与仪器

必需成分：

模板DNA：含目标序列的双链或单链DNA。

引物：一对与目标序列两端互补的短DNA片段（约18–25碱基）

Taq DNA聚合酶：耐高温酶，最初从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离。

dNTPs：四种脱氧核苷三磷酸（A/T/C/G），作为合成新链的原料。

缓冲液：维持pH稳定并提供镁离子（Mg²⁺）作为酶辅因子。

仪器：

热循环仪（PCR仪）：精准控制温度和时间，自动化完成循环。

四、应用与变体技术

基础应用：基因克隆、病原体检测（如新冠病毒核酸检测）、法医DNA分析。

高级技术：

实时定量PCR（qPCR）：实时监测扩增，用于定量分析。

数字PCR（dPCR）：绝对定量，灵敏度更高。

逆转录PCR（RT-PCR）：扩增RNA病毒基因组。

五、历史与突破

发明者：Kary Mullis于1983年提出概念，1993年获诺贝尔化学奖。

里程碑：1988年耐热Taq酶的引入大幅提升扩增效率和特异性。

结语

PCR通过精准的温度控制和酶促反应，实现了DNA的快速扩增，成为现代生命科学的基石技术。从基础研究到临床诊断，其应用不断拓展，而新技术的涌现（如CRISPR结合PCR）将继续推动分子生物学的边界。理解PCR的基本过程，是掌握分子生物学实验的关键第一步。