dna提取与鉴定实验步骤

一、DNA提取的原理

DNA提取的核心是利用其物理化学特性与其他细胞成分分离：

溶解性差异：DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低，而在2 mol/L NaCl溶液中溶解度最高，借此分离蛋白质等杂质

耐高温与耐试剂性：DNA能耐受高温（60–65℃）和洗涤剂（如SDS），而蛋白质会变性

酒精沉淀特性：DNA不溶于冷乙醇（95%），遇冷乙醇会析出白色絮状物

二、实验步骤详解

1.样本选择与预处理

材料选择：优先选用DNA含量高的样本，如鸡血（需加柠檬酸钠抗凝）、菜花、香蕉或洋葱

细胞破碎：

动物细胞（如鸡血）：加蒸馏水低渗裂解，释放细胞核物质

植物细胞（如菜花）：需研磨破碎细胞壁，加入含SDS的研磨液（含Tris、EDTA、NaCl）

2.去除杂质

盐析法：加入高浓度NaCl（2 mol/L）溶解DNA，使蛋白质沉淀

酶解法：加入嫩肉粉（含蛋白酶）或蛋白酶K降解蛋白质

有机溶剂法：用苯酚/氯仿抽提去除蛋白质，或冷乙醇沉淀DNA（常用95%乙醇）

特殊处理：植物样本需加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）结合多酚类杂质

3.DNA析出与纯化

冷乙醇沉淀：向滤液中缓缓加入2倍体积冷乙醇（4℃），玻璃棒单向轻缓搅拌，缠绕白色絮状DNA

洗涤：用66%、80%、95%乙醇梯度洗涤沉淀，去除盐分

溶解保存：纯化后的DNA溶于TE缓冲液或蒸馏水，避免剧烈震荡破坏结构

4.DNA鉴定方法

二苯胺显色法（经典定性）：

DNA与二苯胺试剂在酸性条件下混合，沸水浴10分钟后呈蓝色，颜色深浅反映DNA浓度

紫外分光光度法（定量与纯度）：

测定260 nm吸光度（OD260）计算DNA浓度，OD260/OD280≈1.8表明纯度较高（比值过低提示蛋白质残留）

琼脂糖凝胶电泳（完整性验证）：

DNA在电场中向阳极移动，通过溴化乙锭染色后紫外灯下呈橙红色荧光条带，观察片段大小及降解程度

三、关键注意事项

防DNA降解：

操作全程保持低温（冰浴），添加EDTA抑制DNA酶活性

防污染：

使用无菌器材，佩戴手套/口罩，避免样本交叉污染

操作规范：

搅拌需单向轻柔，防止机械剪切破坏DNA长链

植物样本研磨需充分，否则DNA得率降低

试剂选择：

SDS或苯酚需高质量，避免杂质干扰

四、实验设计优化示例

鸡血DNA提取流程（参考"二三四滤六搅拌"口诀）：

两次加水（裂解细胞）→两次析出DNA（冷乙醇沉淀）→三次溶解于NaCl（调节浓度）→四次过滤（去除杂质）→六次单向搅拌（防断裂）

植物DNA提取改进：

加入PVP结合多酚，用离心柱法替代传统盐析，提高纯度

五、应用场景

DNA提取与鉴定技术广泛应用于：

医学：基因诊断、病原体检测

法医学：个体识别、亲子鉴定（需PCR扩增特定片段）

生物学研究：基因克隆、遗传分析

结语

DNA提取与鉴定是探索生命密码的基础技术实验成功的关键在于理解原理（溶解性、耐热性）、规范操作（防降解/污染）并灵活选择方法（如盐析法低成本、离心柱法高效率）随着技术进步，高效安全的提取试剂盒正逐步普及，但传统方法仍是理解分子生物学核心原理的重要实践