血液dna提取试剂盒步骤

一、基本原理

血液DNA提取的核心目标是分离高纯度基因组DNA，用于PCR、基因测序等分子实验传统酚氯仿法因毒性大、耗时长已被淘汰，现代试剂盒主要采用两类技术：

硅胶膜吸附柱法（如上海莱枫、天根生化等品牌）：通过离液盐使DNA特异性结合硅胶膜，再洗涤纯化

磁珠法（如E.Z.N.A.、PureBind等品牌）：利用磁珠吸附DNA，通过磁场分离杂质

两种方法均能避免有机溶剂，30-60分钟内完成提取，DNA纯度达A260/280≈1.8、A260/230>2.0

二、通用操作步骤

1.样本前处理

抗凝血：EDTA或柠檬酸钠抗凝的全血需混匀，2-8℃保存≤10天，长期存储需-70℃且避免反复冻融

血凝块/陈旧血：需用专用裂解柱（如NP401）或延长蛋白酶K消化时间

样本量：通常适用100μl–2ml血液，微量样本需用PBS稀释

2.细胞裂解与消化

加入裂解液（如Buffer MG-A/BL）和蛋白酶K（20mg/ml），涡旋混匀

55-70℃温浴10-30分钟，彻底分解细胞膜和蛋白质

注：肝素抗凝血需添加Buffer WAK去除肝素干扰

若需RNA-free DNA，可加入RNase A

3.DNA结合纯化

硅胶膜法：

将裂解液转移至吸附柱，加结合缓冲液（如含异丙醇的Buffer GBH），离心使DNA结合硅胶膜

磁珠法：

加入磁珠和结合液，孵育后磁吸弃上清，DNA吸附于磁珠

4.洗涤去杂

用含乙醇的洗涤液（如Buffer WAG/WB1）离心或磁吸清洗2-3次，去除蛋白质、盐离子等杂质

关键：洗涤液需提前按说明加无水乙醇（如Buffer WB1加乙醇后使用）

5.洗脱与保存

空离心柱/磁珠干燥5分钟，避免乙醇残留

加洗脱缓冲液（TE或水，pH 7.0-8.5），离心或孵育洗脱DNA

洗脱液65℃预热可提高DNA得率20%

-20℃保存备用

三、关键注意事项

样本质量：

溶血、脂血或反复冻融样本会降低DNA产量

鸟类/两栖类血液需减量（如≤10μl）并延长裂解时间

试剂操作：

蛋白酶K避免反复冻融；洗涤液现配现用

裂解液含刺激性化合物，需戴手套、护目镜操作

常见问题解决：

DNA产量低：增加裂解液用量、二次洗脱或延长结合时间

DNA降解：避免剧烈振荡或高温裂解（＞70℃）

乙醇残留：延长干燥时间，残留会抑制PCR

四、技术优势与适用场景

方法适用场景优势

硅胶膜法常规抗凝血（1ml样本得20-50μg DNA）成本低，兼容自动化设备

磁珠法微量样本、高通量检测速度快（≤30分钟），无离心需求

特殊应用：

法医样本（唾液、精斑）可用硅胶柱法提取

线粒体DNA提取需优化裂解条件

五、总结

血液DNA提取试剂盒通过标准化流程显著提升实验效率，但需严格遵循操作细节选择时需考虑样本类型（新鲜/陈旧/抗凝方式）、下游应用（如PCR需高纯度，测序需大片段）及通量需求随着磁珠法等新技术普及，提取效率与安全性将持续优化