外周DNA提取与鉴定的科学指南
外周DNA（如血液、唾液中的游离DNA）是疾病诊断、遗传分析和法医学的重要生物标志物其提取与鉴定需严格遵循操作规范，以下为关键注意事项：
一、样本采集与保存
样本选择：优先使用新鲜、无溶血的外周血或唾液样本陈旧或溶血样本会导致DNA降解，影响提取效率
抗凝剂使用：血液样本需用EDTA或柠檬酸钠抗凝，防止凝固（柠檬酸钠还可稳定细胞）
无菌操作：全程佩戴一次性手套，使用无菌耗材和DEPC水，避免外源DNA酶污染
运输与储存：
短期保存：4℃冷藏，避免反复冻融
长期保存：-20℃或-70℃冷冻（血浆游离DNA需-70℃保存≥3年）
运输时保持低温，避免光照和高温
特殊场景：孕妇外周血胎儿游离DNA提取时，需注意：
采血后离心分离血浆，避免吸入白细胞层
血浆应为淡黄色，凝血或溶血样本需重新采集
二、DNA提取操作要点
细胞裂解：
裂解液选择：SDS（十二烷基硫酸钠）可破坏细胞膜，但浓度需精确（通常0.5%），pH严格调至8.0以防DNA溶解损失
温度控制：裂解液需预热（如65℃），促进蛋白变性
杂质去除：
红细胞裂解：用低渗溶液（如去离子水）选择性裂解红细胞，1700rpm离心去除碎片
蛋白分离：酚/氯仿抽提时需轻缓操作，避免吸入界面杂质；有机溶剂（苯酚、氯仿）具腐蚀性和毒性，操作需防护
DNA沉淀与纯化：
沉淀剂：预冷的无水乙醇或异丙醇（-20℃）可提高DNA得率
离心后需用70%乙醇洗涤沉淀，去除盐分
防降解措施：
避免强酸环境（导致DNA脱嘌呤断裂）
操作轻柔，减少机械剪切力（如用大口吸管转移）
特殊技术：
磁珠法提取游离DNA时，磁珠需平衡至室温，吸弃上清避免吸到磁珠
提取后DNA溶液应为无色透明，无悬浮物；浓度需在0.05-0.70 ng/μl（游离DNA标准）
三、DNA鉴定与质控
浓度与纯度检测：
紫外分光光度法：OD260/OD280比值应≈1.8（>1.7合格），OD260/OD230>2.0，提示无蛋白或有机溶剂污染
完整性鉴定：
凝胶电泳：观察条带是否清晰（基因组DNA呈单一高分子量条带），降解DNA呈弥散状
PCR扩增：检测特定基因片段，若扩增失败提示存在抑制剂或DNA损伤
污染监控：
设立空白对照（无模板样本），排除试剂污染
毛细管电泳STR检测中，峰值失衡或额外峰可能提示污染或抑制剂存在
四、常见问题与解决方案
问题原因解决措施
DNA得率低裂解不充分或沉淀不全优化裂解液浓度、延长低温沉淀时间
DNA降解样本陈旧或操作温度高使用新鲜样本，全程低温操作
A260/A280异常蛋白或酚残留增加酚/氯仿抽提次数，彻底洗涤
PCR抑制乙醇或重金属残留70%乙醇充分洗涤，更换纯化方法
五、应用场景与局限性
应用：
疾病诊断：肿瘤基因突变筛查、遗传病分析（如21-三体综合征检出率99%）
法医学：亲子鉴定、个体识别（DNA匹配准确率>99.99%）
局限性：
游离DNA检测不适用于多胎妊娠或神经管缺陷筛查
环境DNA易受降解影响，需结合其他技术验证
结语
外周DNA提取与鉴定是分子生物学的基石技术严格遵守无菌规范、精准控制实验条件、系统验证结果质量，是获得可靠数据的关键随着技术进步（如高通量测序），外周DNA将在精准医学中发挥更大价值
客服