1.变性（Denaturation）
温度与作用：在高温（通常为94–95°C）下，双链DNA的氢键断裂，两条互补链解离为单链，形成后续反应的模板。
时间与细节：首次变性需较长时间（如1–5分钟），确保模板完全解链；后续循环中，变性时间缩短至20–30秒。这一步骤的关键在于破坏DNA的二级结构，避免残留双链影响引物结合。
2.退火（Annealing）
温度与作用：温度降至50–65°C（通常55°C左右），引物与模板DNA单链的互补区域特异性结合。引物的设计需与目标序列两端匹配，确保扩增的特异性。
影响因素：退火温度取决于引物的Tm值（熔解温度）。温度过高会导致引物无法结合，过低则可能引发非特异性结合。例如，
提到“温度需降至引物Tm值以下”，而指出退火温度常设为55°C。
3.延伸（Extension）
温度与作用：在72°C下，耐热DNA聚合酶（如Taq酶）以dNTP为原料，沿模板从引物3'端开始合成新链。
时间与效率：延伸时间由目标片段长度决定，一般按1分钟/kb计算。例如，扩增1kb片段需1分钟，而
提到“每1kb增加30–60秒”。此阶段完成后，DNA拷贝数翻倍。
循环与指数扩增
PCR通过重复上述三步循环（通常20–40次），使目标DNA呈指数增长。例如：
第1–2个循环：仅生成长链DNA，无短目标片段。
第3个循环后：短目标片段开始出现，并逐渐占据主导。
30个循环后：DNA可扩增至10亿倍（理论上为
倍）。
关键组分与优化
引物设计：需避免发夹结构或二聚体，长度通常18–25bp。
酶的选择：热稳定性是核心，如Taq酶可耐受高温变性步骤。
温度控制：热循环仪需精确调控温度和时间，避免非特异性产物。
应用与意义
PCR技术广泛应用于基因克隆、疾病诊断（如核酸检测）、法医学鉴定等领域。其高效性和特异性使其成为分子生物学的基石技术，例如在COVID-19检测中，RT-PCR（结合逆转录步骤）用于病毒RNA的快速筛查。
通过理解这三个核心步骤，我们可以更深入地掌握PCR的原理，并针对不同实验需求优化条件，从而推动科研与医疗的进步。
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