第一步：变性（Denaturation）——打开DNA双链的“高温钥匙”
在95°C左右的高温下（通常持续20-30秒），DNA双链间的氢键被破坏，双螺旋结构解链为两条单链DNA，为后续引物结合提供模板。此步骤需严格控制温度，温度不足会导致解链不完全，而过高可能损伤DNA聚合酶。现代热循环仪可精准调控温度，确保反应高效进行。
第二步：退火（Annealing）——引物与模板的“精准配对”
温度降至50-65°C（根据引物设计调整），引物（短单链DNA片段）通过碱基互补原则与目标DNA区域结合。引物设计至关重要：长度通常为18-25个碱基，GC含量需平衡（40%-60%），避免自身配对或与非目标区域结合。退火温度过低会导致非特异性结合，过高则引物无法结合，需通过公式计算优化。
第三步：延伸（Extension）——DNA合成的“酶促工厂”
温度升至70-72°C，耐高温的Taq DNA聚合酶以单链DNA为模板，从引物3'端开始合成互补链，每秒可添加约60个核苷酸。延伸时间取决于目标片段长度（如1 kb需约1分钟）。此阶段需dNTPs（脱氧核苷三磷酸）作为原料，Mg²⁺作为辅因子。最终，每个循环使DNA数量翻倍，经过25-40次循环后可获得数百万倍扩增。
循环与优化：从微量到海量的DNA制造
上述三步构成一个循环，通常重复25-35次以避免非特异性扩增。前1-5个循环为“指数前期”，之后进入高效扩增阶段。最终扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光检测（如qPCR）验证。实验需注意避免污染，并优化反应体系（如引物浓度、Mg²⁺浓度）以提高特异性。
PCR的应用：从实验室到现实世界的变革
PCR技术已广泛应用于：
医学诊断：如新冠病毒检测、遗传病筛查；
法医学：通过微量DNA进行个体识别；
古生物学：从化石中提取并分析远古生物DNA；
基因工程：用于基因克隆、CRISPR编辑等。
结语
PCR的三个步骤——变性、退火和延伸——看似简单，却蕴含着精密的生化调控。自1983年Kary Mullis发明以来，这项技术不断革新，成为现代生命科学的基石。无论是揭示疾病机制，还是探索生命起源，PCR始终是科学家手中不可或缺的“分子放大镜”。
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