外周血细胞基因组dna的提取与鉴定实验

外周血细胞基因组DNA的提取与鉴定：分子生物学的基石技术

引言

外周血细胞是获取人类基因组DNA的常用样本，因其易于采集且富含白细胞（含完整细胞核DNA），在遗传病诊断、法医学鉴定、肿瘤基因分析等领域广泛应用本文将从实验原理、操作步骤、质量鉴定到注意事项，系统介绍这一基础技术

一、实验原理

DNA提取的核心是破坏细胞结构并纯化DNA分子：

红细胞裂解：低渗溶液（如去离子水）裂解红细胞，保留白细胞

白细胞裂解：裂解液（含SDS、蛋白酶K）破坏细胞膜与核膜，释放DNA

SDS：溶解膜脂质、解聚核蛋白

蛋白酶K：降解蛋白质杂质

DNA纯化：

有机溶剂法（酚/氯仿）：去除蛋白质

沉淀法（异丙醇/乙醇）：沉淀DNA并去除盐分

杂质去除：通过离心、柱层析或磁珠法分离DNA

二、实验步骤详解

以经典流程为例（结合）：

样本准备：

采集EDTA抗凝外周血（2-5ml），避免溶血或污染

红细胞裂解：

加去离子水或低渗缓冲液，离心去除上清（重复1-2次）

白细胞裂解与DNA释放：

加入裂解液（含0.5%SDS、蛋白酶K），37℃孵育30分钟

DNA纯化：

酚/氯仿法：振荡混匀后离心，取水相（含DNA）

沉淀法：加异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤

DNA溶解：用TE缓冲液（pH 8.0）溶解沉淀

三、DNA质量鉴定方法

提取的DNA需通过三项关键检测：

浓度与纯度：

紫外分光光度法测定A260/A280比值：

1.8–2.0表示高纯度（蛋白质污染少）

A260值计算浓度（1 OD≈50μg/ml DNA）

完整性：

琼脂糖凝胶电泳：观察条带是否完整（主条带>10kb），无RNA或降解碎片

功能性验证：

PCR扩增：检测特定基因片段是否可成功扩增

四、不同提取方法的比较

方法优点缺点适用场景

酚/氯仿法成本低、DNA完整性好有毒试剂、操作复杂科研大批量样本

盐析法安全快速纯度较低快速筛查

硅胶/磁珠法纯度高、自动化程度高成本高临床诊断（如试剂盒）

Silica-KI法快速（15分钟）、安全需优化吸附条件急诊检测

注：商业试剂盒（如Qiagen、TIANGEN）整合了裂解、结合、洗涤步骤，适合标准化操作

五、关键注意事项

防污染：

全程戴手套，使用无菌耗材，避免外源DNA或酶污染

样本质量：

使用新鲜抗凝血（4℃保存≤72小时），避免反复冻融

试剂选择：

裂解液pH需稳定（pH 8.0），防止DNA酸降解

操作技巧：

沉淀DNA时轻柔振荡，避免机械剪切

乙醇洗涤后充分晾干，避免残留抑制PCR

保存条件：

DNA溶于TE缓冲液，-20℃或-80℃长期保存

六、应用场景

遗传病研究：如家族性肾小球硬化症基因筛查（TRPC6基因）

肿瘤诊断：实体瘤突变分析（如Ion AmpliSeq Panel测序）

法医学：STR分型用于个体识别

基因治疗：造血干细胞基因编辑后的DNA整合检测

结语

外周血DNA提取是分子生物学的核心技术，其质量直接影响下游实验结果选择合适方法（如科研首选酚/氯仿法，临床优选试剂盒）、严格操作流程、重视质量鉴定，方能获得高纯度、完整的DNA，为生命科学研究与医学应用奠定可靠基础