质粒提取实验步骤

质粒提取实验：从原理到操作

质粒是细菌细胞内独立于染色体的环状双链DNA分子，广泛用于基因克隆、药物研发和分子生物学研究提取高纯度质粒DNA是实验成功的关键，常用方法为碱裂解法（Alkaline Lysis），其核心原理是利用pH变化选择性分离质粒与染色体DNA

分子实验质粒提取原理

实验目的

获取纯净质粒DNA，用于测序、酶切、转化等下游实验

去除细菌蛋白、RNA及基因组DNA等杂质

实验步骤详解

以碱裂解法为例（小量提取）：

细菌培养与收集

将含目标质粒的细菌（如大肠杆菌）在含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-17小时

取1-5 mL菌液，离心（12,000 rpm,1分钟）弃上清，收集菌体沉淀

沉浸式体验分子克隆全流程——质粒提取

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菌体裂解

悬浮细胞：加入预冷的Solution I（含RNase A），涡旋振荡充分悬浮沉淀

注：Solution I中的Tris-HCl缓冲液保护DNA，RNase降解RNA

裂解细胞：加入Solution II（含NaOH和SDS），温和颠倒混匀5-10次，溶液变透明粘稠

关键点：避免剧烈振荡，防止染色体DNA断裂污染

中和沉淀：加入Solution III（含醋酸和SDS），立即温和混匀，形成白色絮状沉淀（变性的蛋白质和染色体DNA）

质粒纯化

离心（12,000 rpm,10分钟），取上清液转移至吸附柱

用Wash Buffer（含乙醇）洗涤吸附柱2次，离心去除杂质

空离1分钟彻底去除乙醇残留

质粒洗脱与保存

加入TE缓冲液或无菌水，静置1分钟后离心洗脱DNA

质粒溶液短期存于4℃，长期存于-20℃或-70℃

质量检测

浓度与纯度

紫外分光光度计检测：OD260/OD280≈1.8为高纯度质粒；

<1.8提示蛋白污染，>1.8提示RNA残留

完整性

琼脂糖凝胶电泳：观察质粒超螺旋、线状或开环构型

关键注意事项

菌体状态：使用对数生长期细菌（过夜培养），老化菌体质粒易丢失

操作轻柔：加Solution II后避免剧烈震荡，防止染色体DNA污染

彻底去乙醇：残留乙醇抑制酶切反应，需充分空离或晾干

洗脱优化：增加洗脱液体积或延长静置时间可提高得率

常见问题解决

问题可能原因解决方案

质粒浓度低菌量不足/质粒拷贝数低增加菌液体积/换高拷贝载体

电泳出现杂带RNA污染或质粒降解添加RNase/更换新鲜试剂

酶切效率低乙醇残留或蛋白污染充分洗涤/重复纯化

为什么选择碱裂解法？

该方法由Birnboim和Doly于1979年提出

优势在于：

快速高效：30分钟内完成小量提取

高特异性：利用pH差异选择性沉淀染色体DNA

适用性广：兼容后续测序、转化等实验

拓展知识

替代方法：煮沸法（适合小质粒）、去污剂裂解法（适用于大质粒）

创新趋势：试剂盒自动化（如吸附柱技术）显著提升纯度和效率

通过严谨操作与原理理解，质粒提取将成为探索基因奥秘的可靠起点！