质粒提取实验:从原理到操作
质粒是细菌细胞内独立于染色体的环状双链DNA分子,广泛用于基因克隆、药物研发和分子生物学研究提取高纯度质粒DNA是实验成功的关键,常用方法为碱裂解法(Alkaline Lysis),其核心原理是利用pH变化选择性分离质粒与染色体DNA
分子实验质粒提取原理
实验目的
获取纯净质粒DNA,用于测序、酶切、转化等下游实验
去除细菌蛋白、RNA及基因组DNA等杂质
实验步骤详解
以碱裂解法为例(小量提取):
细菌培养与收集
将含目标质粒的细菌(如大肠杆菌)在含抗生素的LB液体培养基中,37℃振荡培养12-17小时
取1-5 mL菌液,离心(12,000 rpm,1分钟)弃上清,收集菌体沉淀
沉浸式体验分子克隆全流程——质粒提取
实验室“杀手”倾情分享质粒提取实验全流程,来辩论吧~
菌体裂解
悬浮细胞:加入预冷的Solution I(含RNase A),涡旋振荡充分悬浮沉淀
注:Solution I中的Tris-HCl缓冲液保护DNA,RNase降解RNA
裂解细胞:加入Solution II(含NaOH和SDS),温和颠倒混匀5-10次,溶液变透明粘稠
关键点:避免剧烈振荡,防止染色体DNA断裂污染
中和沉淀:加入Solution III(含醋酸和SDS),立即温和混匀,形成白色絮状沉淀(变性的蛋白质和染色体DNA)
质粒纯化
离心(12,000 rpm,10分钟),取上清液转移至吸附柱
用Wash Buffer(含乙醇)洗涤吸附柱2次,离心去除杂质
空离1分钟彻底去除乙醇残留
质粒洗脱与保存
加入TE缓冲液或无菌水,静置1分钟后离心洗脱DNA
质粒溶液短期存于4℃,长期存于-20℃或-70℃
质量检测
浓度与纯度
紫外分光光度计检测:OD260/OD280≈1.8为高纯度质粒;
<1.8提示蛋白污染,>1.8提示RNA残留
完整性
琼脂糖凝胶电泳:观察质粒超螺旋、线状或开环构型
关键注意事项
菌体状态:使用对数生长期细菌(过夜培养),老化菌体质粒易丢失
操作轻柔:加Solution II后避免剧烈震荡,防止染色体DNA污染
彻底去乙醇:残留乙醇抑制酶切反应,需充分空离或晾干
洗脱优化:增加洗脱液体积或延长静置时间可提高得率
常见问题解决
问题可能原因解决方案
质粒浓度低菌量不足/质粒拷贝数低增加菌液体积/换高拷贝载体
电泳出现杂带RNA污染或质粒降解添加RNase/更换新鲜试剂
酶切效率低乙醇残留或蛋白污染充分洗涤/重复纯化
为什么选择碱裂解法?
该方法由Birnboim和Doly于1979年提出
优势在于:
快速高效:30分钟内完成小量提取
高特异性:利用pH差异选择性沉淀染色体DNA
适用性广:兼容后续测序、转化等实验
拓展知识
替代方法:煮沸法(适合小质粒)、去污剂裂解法(适用于大质粒)
创新趋势:试剂盒自动化(如吸附柱技术)显著提升纯度和效率
通过严谨操作与原理理解,质粒提取将成为探索基因奥秘的可靠起点!