质粒DNA的提取与鉴定：分子生物学的基石技术
质粒是存在于细菌细胞内的环状双链DNA分子，能独立于染色体进行复制和遗传，广泛应用于基因工程、药物研发等领域
其提取与鉴定是分子生物学实验的核心基础，主要分为以下步骤：
一、提取原理：利用DNA变复性差异
质粒DNA与染色体DNA在结构上存在关键差异：
质粒DNA：共价闭合环状结构，抗变性能力强
染色体DNA：线性大分子，易在碱性条件下彻底变性
当溶液pH升至12.0–12.6时（常用NaOH溶液），染色体DNA氢键断裂、双螺旋解旋成单链并形成网状沉淀；而质粒DNA仅部分变性，中和后（如用醋酸钾）可快速复性溶解于上清液中，从而实现分离
✅核心方法：碱裂解法（90%以上实验采用）
该方法由Birnboim和Doly于1979年提出
因操作简单、纯度较高成为行业标准
二、提取步骤详解
以碱裂解法小量提取为例（操作全程需低温防降解）：
细菌培养与收集
将含目标质粒的大肠杆菌接种于含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜
取1.5ml菌液离心（4000 rpm,3min），弃上清得菌体沉淀
细胞裂解与DNA分离
重悬：沉淀中加入预冷的溶液I（含葡萄糖、Tris·Cl、EDTA），维持渗透压并抑制DNase活性
裂解：加入溶液II（NaOH+SDS），轻柔混匀至溶液变粘稠（避免剧烈震荡防止DNA断裂），冰浴5min使细胞完全裂解
中和：加入溶液III（醋酸钾/冰乙酸混合液），轻柔颠倒混匀生成白色絮状沉淀（含染色体DNA、蛋白质-SDS复合物及杂质）
质粒DNA纯化
离心（12000 rpm,10min），取上清液（含质粒DNA）
进一步纯化可选：
乙醇沉淀法：加入无水乙醇沉淀DNA，离心后洗涤干燥
试剂盒法：硅胶膜吸附柱在高盐下结合DNA，低盐缓冲液洗脱（省时高效）
酚/氯仿抽提：去除残留蛋白质（注意酚有剧毒，需规范操作）
⚠️关键注意事项
裂解时间过长或震荡过猛会导致质粒断裂
低拷贝质粒需增加菌体量并优化溶液比例
洗脱液pH需为7.0–8.5，否则影响DNA稳定性
三、鉴定方法：多维度验证质粒质量
电泳鉴定
琼脂糖凝胶电泳：质粒DNA呈3条带（超螺旋、开环、线性），通过迁移位置判断大小和纯度
酶切电泳：用限制性内切酶（如Hind III、BamH I）切割质粒，电泳后比对片段大小是否符合预期
浓度与纯度检测
紫外分光光度法：
OD260值计算DNA浓度（1 OD≈50μg/ml双链DNA）
OD260/OD280≈1.8–2.0为高纯度（低于1.8提示蛋白质污染）
荧光法：溴化乙锭（EB）嵌入DNA后荧光增强，可定量
功能验证法
PCR鉴定：扩增目标基因片段，确认质粒携带正确序列
二苯胺显色：DNA遇二苯胺变蓝，用于粗提物快速鉴定
四、应用与意义
质粒提取与鉴定技术是基因克隆、重组蛋白表达（如胰岛素、疫苗生产）及CRISPR基因编辑的核心前提
随着试剂盒的普及，该技术已高度标准化，但理解原理仍可帮助优化实验（如大质粒提取需改用去污剂裂解法）
客服