全血dna提取实验步骤

一、实验原理与材料准备

全血DNA提取的核心是分离白细胞中的基因组DNA，因其红细胞膜会破坏DNA完整性实验需使用抗凝剂（如EDTA或肝素）采集血液样本，防止凝固并保持DNA稳定性所需材料包括：抗凝全血、红细胞裂解液、蛋白酶K、酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液及离心机等

二、实验步骤详解

样本采集与处理

使用含EDTA的采血管采集全血，低温保存（-20℃至-80℃）以避免DNA降解

若为大规模样本，推荐使用EDTA抗凝剂，因其能有效抑制血液凝固并保持DNA完整性

红细胞裂解

将全血样本与红细胞裂解液混合，离心去除上清液，保留沉淀物（含白细胞）

重复洗涤步骤以去除血红素等杂质

蛋白酶K处理

加入蛋白酶K溶液（20mg/mL），在55℃～66℃水浴中孵育4小时，消化蛋白质

通过离心机分离细胞碎片，确保DNA释放

DNA释放与纯化

使用酚/氯仿/异戊醇抽提液（25:24:1）两次，分离蛋白质和脂类杂质

用无水乙醇沉淀DNA，离心后弃去上清液，倒干沉淀

70%乙醇洗涤沉淀，进一步纯化DNA

DNA洗脱与溶解

将DNA沉淀用洗脱缓冲液（如TE缓冲液）重悬，加热至65℃促进溶解

保存于-20℃冰箱中，或直接用于PCR等下游实验

三、试剂盒法操作（以Takara为例）

红细胞裂解

加入GenTLE Solution I，离心后去除上清液

重复步骤以确保红细胞完全裂解

DNA提取与纯化

加入GenTLE Solution II和III，离心后收集上清液

用异丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤后干燥

洗脱与保存

用TE缓冲液洗脱DNA，加热至65℃溶解

保存于-20℃，避免反复冻融

四、注意事项与常见问题

避免污染：操作需在无菌条件下进行，防止外源DNA污染

控制温度：蛋白酶K和酚氯仿处理需严格控制温度，避免DNA降解

离心参数：根据样本量调整离心速度和时间（如12,000 rpm,5分钟）

常见问题：

DNA提取效率低：可增加裂解时间或优化缓冲液比例

DNA纯度不足：增加酚氯仿抽提次数或使用磁珠法

DNA降解：避免高温处理或长时间暴露

五、结果分析与质量检测

DNA浓度与纯度：

使用分光光度计测定A260/A280比值（1.8-2.0）和A260/A230比值（>1.8）

电泳分析显示DNA条带清晰、无降解

质量标准：

理想DNA浓度为50-100ng/μL，纯度符合实验需求

适用于PCR、测序等下游实验

六、总结

全血DNA提取需结合红细胞裂解、蛋白酶K消化和酚氯仿抽提等步骤，通过试剂盒法可简化操作并提高效率掌握标准化流程和注意事项，可显著提升DNA纯度和提取成功率不同方法（如酚氯仿法与磁珠法）可根据实验需求选择，但需注意样本量和试剂配比