1.变性：DNA双链的分离
温度条件：90–95°C，持续20秒至2分钟。
过程：高温破坏DNA双链间的氢键，使双链解离为单链模板。初始循环中需较长时间（如2分钟）确保完全解链，后续循环中时间缩短。
意义：为引物结合和后续复制提供单链模板。
2.退火：引物与模板结合
温度条件：50–65°C（依引物设计而定），持续20–30秒。
过程：降温后，特异性引物（短单链DNA片段）通过碱基互补配对与单链DNA的靶序列区域结合。正向和反向引物分别结合两条互补链的3'端。
关键因素：引物设计需精确匹配靶序列，退火温度过高或过低会导致非特异性结合或无法结合。
3.延伸：新链的合成
温度条件：70–72°C，时间依产物长度调整（通常每1kb延长30–60秒）。
过程：耐高温DNA聚合酶（如Taq酶）以dNTPs为原料，沿引物的3'端延伸，合成与模板互补的新链。
终末延伸：最后一次循环后，需72°C保持3–10分钟，确保所有产物完整延伸。
循环次数与指数扩增
典型循环为20–40次，每循环使DNA拷贝数翻倍。例如，30次循环可扩增约10^9倍。
早期循环以积累产物为主，后期因酶活性和底物限制，增速放缓（平台效应）。
关键组分与辅助步骤
引物：决定扩增特异性，需避免自身互补或形成二聚体。
DNA聚合酶：Taq酶耐高温，但缺乏纠错功能；高保真酶可减少错误。
样品制备：需提取高质量模板DNA并去除抑制剂（如蛋白质）。
产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光定量分析。
应用领域
PCR技术广泛应用于：
疾病诊断（如新冠病毒检测）
法医学（微量DNA分析）
古生物学（古代DNA研究）
基因工程（CRISPR载体构建）
通过精确控制温度和时间，PCR实现了对特定DNA片段的快速、高效扩增，成为现代分子生物学不可或缺的工具。
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